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CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖和活力的原理、方法及注意事項(xiàng)

更新時(shí)間:2024-08-13      點(diǎn)擊次數(shù):2040

CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖和活力的原理、方法及注意事項(xiàng)

引言

Cell Counting Kit-8(簡(jiǎn)稱CCK-8)是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)研究中的試劑,主要用于簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞增殖和活力。CCK-8基于WST-8(化學(xué)名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽)的還原反應(yīng),通過生成高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物(Formazan dye)來反映活細(xì)胞的數(shù)量和活力。本文將詳細(xì)介紹CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖和活力的原理、方法及注意事項(xiàng)。

原理

CCK-8試劑中的WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓(1-Methoxy PMS)的作用下,被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物。這一還原反應(yīng)與活細(xì)胞的數(shù)量和活力直接相關(guān),生成的甲瓚物數(shù)量越多,表示活細(xì)胞數(shù)量越多,細(xì)胞活力越強(qiáng)。因此,通過測(cè)定甲瓚物的吸光度(OD值),可以間接反映細(xì)胞的增殖和活力情況。

方法

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

  1. 儀器與試劑:準(zhǔn)備臺(tái)式離心機(jī)、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、酶標(biāo)儀(450nm濾光片)、CCK-8檢測(cè)試劑盒、DMEM或其他培養(yǎng)基、雙抗、FBS、PBS、DMSO等。

  2. 細(xì)胞懸液制備:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行消化、離心、計(jì)數(shù),并制備成適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液。

實(shí)驗(yàn)步驟

  1. 細(xì)胞接種:在96孔板中接種細(xì)胞懸液,每孔約100μL,細(xì)胞數(shù)量根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整,一般貼壁細(xì)胞為3k-7k/孔,懸浮細(xì)胞可適當(dāng)增加。將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)(37℃,5% CO2)。

  2. 藥物處理(如適用):向培養(yǎng)板中加入不同濃度的待測(cè)藥物或化合物,繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間(如6、12、24或48小時(shí))。

  3. CCK-8檢測(cè):每孔加入10μL CCK-8溶液,注意避免產(chǎn)生氣泡。將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中孵育1-4小時(shí)。

  4. 吸光度測(cè)定:使用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)定各孔的吸光度(OD值)。

  5. 數(shù)據(jù)處理:根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞存活率或抑制率,公式為:細(xì)胞存活率 = [(實(shí)驗(yàn)孔 - 空白孔) / (對(duì)照孔 - 空白孔)] × 100%;抑制率 = [(對(duì)照孔 - 實(shí)驗(yàn)孔) / (對(duì)照孔 - 空白孔)] × 100%。

注意事項(xiàng)

  1. 細(xì)胞數(shù)量:細(xì)胞數(shù)量過低會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,建議預(yù)先摸索合適的細(xì)胞接種數(shù)量。

  2. 氣泡干擾:加樣過程中避免產(chǎn)生氣泡,氣泡會(huì)干擾OD值的讀數(shù)。

  3. 培養(yǎng)板邊緣孔:培養(yǎng)板最外一圈的孔容易干燥揮發(fā),建議只加培養(yǎng)基,不作為測(cè)定孔用。

  4. 藥物影響:如果待測(cè)藥物具有氧化還原性,可在加入CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基,以去除藥物影響。

  5. CCK-8保存:CCK-8試劑應(yīng)保存在4℃或-20℃避光條件下,避免反復(fù)凍融。

  6. 波長(zhǎng)選擇:對(duì)于高渾濁度的細(xì)胞懸液,建議采用雙波長(zhǎng)測(cè)定,檢測(cè)波長(zhǎng)450-490nm,參比波長(zhǎng)600-650nm。

結(jié)論

CCK-8作為一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和活力檢測(cè)試劑,在細(xì)胞生物學(xué)研究中具有廣泛應(yīng)用。通過掌握其檢測(cè)原理、方法及注意事項(xiàng),可以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。未來,隨著技術(shù)的不斷發(fā)展,CCK-8將在更多領(lǐng)域發(fā)揮其重要作用。

參考文獻(xiàn)

  1. Bao K, Li Y, Wei J, et al. Fangchinoline suppresses conjunctival melanoma by directly binding FUBP2 and inhibiting the homologous recombination pathway. Cell Death Dis. 2021;12(4):380.

  2. Pu X, Ye Q, Cai J, et al. Typing FGFR2 translocation determines the response to targeted therapy of intrahepatic cholangiocarcinomas. Cell Death Dis. 2021;12(3):256.


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