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Tiangen DP117無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒用戶指南:高純度質(zhì)粒制備技術方案

更新時間:2025-05-02      點擊次數(shù):290

Tiangen DP117無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒用戶指南:高純度質(zhì)粒制備技術方案

一、產(chǎn)品核心特性與工作原理

1. 技術優(yōu)勢與試劑盒組成

  • 核心特性

    • 高效去內(nèi)毒素:采用硅膠膜吸附技術結合去內(nèi)毒素系統(tǒng),內(nèi)毒素去除率>99%,殘留量<0.1 EU/μg DNA,符合細胞轉染及動物實驗標準;

    • 超螺旋結構保留:通過溫和裂解體系(P2緩沖液)與多步離心過濾(CS1過濾器),超螺旋質(zhì)粒占比>85%,顯著提升轉染效率;

    • 高通量處理:單次可處理100-200 mL菌液,高拷貝質(zhì)粒得率達500-1500 μg,低拷貝質(zhì)粒得率200-600 μg,滿足大規(guī)模實驗需求。

  • 試劑盒組成

    • 裂解系統(tǒng):溶液P1(含RNase A)、溶液P2(裂解液)、溶液P4(中和液);

    • 純化系統(tǒng):平衡液BL、漂洗液PW(含無水乙醇)、無水乙醇、洗脫液TB;

    • 耗材:吸附柱CP6(50 mL離心管適配)、收集管、過濾器CS1。

2. 適用范圍與兼容性

  • 下游應用

    • 常規(guī)實驗:酶切、PCR、測序、連接、轉化;

    • 實驗:基因治療載體構建、顯微注射、RNA干擾、CRISPR-Cas9基因編輯;

    • 細胞實驗:適用于內(nèi)毒素敏感型細胞(如Huh7、HEK293T)的轉染,轉染效率較普通質(zhì)粒提升30%-50%。

  • 質(zhì)粒兼容性

    • 拷貝數(shù):高拷貝質(zhì)粒(如pUC19)推薦菌液量100 mL,低拷貝質(zhì)粒(如pBR322)推薦菌液量200 mL;

    • 大小范圍:支持1-20 kb質(zhì)粒提取,對于>10 kb大質(zhì)粒,需增加菌液量及裂解液體積。

二、典型應用場景與實驗方案

1. 基因治療載體構建

  • 實驗設計

    1. 使用DP117提取慢病毒載體骨架質(zhì)粒(如pLVX-IRES-ZsGreen1),菌液量200 mL;

    2. 定量檢測濃度(OD260)及純度(OD260/OD280=1.8-2.0),瓊脂糖凝膠電泳驗證超螺旋結構;

    3. 結合Lipofectamine 3000轉染293T細胞,48小時后熒光顯微鏡觀察轉染效率>80%。

  • 結果示例

    • 提取的質(zhì)粒濃度達1.2 μg/μL,內(nèi)毒素含量0.05 EU/μg,顯著低于普通試劑盒(>1 EU/μg);

    • 慢病毒滴度達1×10? TU/mL,較含內(nèi)毒素質(zhì)粒提升40%。

2. CRISPR-Cas9基因編輯

  • 實驗設計

    1. 提取sgRNA表達質(zhì)粒(如pX458),菌液量100 mL;

    2. 通過DP117去除內(nèi)毒素,避免非特異性免疫激活;

    3. 核轉染HeLa細胞,72小時后T7E1酶切驗證編輯效率>35%。

  • 結果示例

    • 提取的質(zhì)粒OD260/OD280=1.85,內(nèi)毒素未檢出;

    • 基因編輯效率較含內(nèi)毒素質(zhì)粒提升25%,脫靶率降低15%。

3. 動物體內(nèi)實驗

  • 實驗設計

    1. 提取治療性基因表達質(zhì)粒(如pAAV-CMV-GFP),菌液量200 mL;

    2. 通過DP117確保內(nèi)毒素<0.1 EU/μg,避免小鼠注射后發(fā)熱反應;

    3. 尾靜脈注射C57BL/6小鼠(50 μg/只),7天后肝臟組織GFP熒光強度較含內(nèi)毒素質(zhì)粒組提升60%。

  • 結果示例

    • 質(zhì)粒純度(OD260/OD280=1.92)及內(nèi)毒素水平符合FDA要求;

    • 動物存活率100%,無炎癥反應。

三、操作規(guī)范與注意事項

1. 實驗前準備

  • 試劑配制

    1. 溶液P1:加入RNase A后混勻,4℃保存;

    2. 漂洗液PW:按標簽要求加入無水乙醇;

    3. 洗脫液TB:65-70℃預熱以提高洗脫效率。

  • 儀器校準

    • 離心機:確保轉速誤差<2%(8000 rpm對應8228×g);

    • 移液器:定期校準,避免體積誤差。

2. 操作流程

  • 菌體收集

    1. 100-200 mL菌液8000 rpm離心3分鐘,棄上清;

    2. 菌體沉淀用吸水紙吸干殘留培養(yǎng)基。

  • 裂解與中和

    1. 加入8 mL溶液P1,渦旋振蕩至菌體懸??;

    2. 加入8 mL溶液P2,溫和翻轉6-8次,室溫放置5分鐘;

    3. 加入8 mL溶液P4,立即翻轉6-8次,室溫放置10分鐘。

  • 過濾與純化

    1. 裂解液8000 rpm離心5分鐘,上清倒入過濾器CS1,緩慢推動推柄過濾;

    2. 濾液加入0.3倍體積異丙醇,分兩次過吸附柱CP6;

    3. 依次加入10 mL漂洗液PW、3 mL無水乙醇洗滌,8000 rpm離心2分鐘棄廢液;

    4. 空柱8000 rpm離心5分鐘,去除乙醇殘留。

  • 洗脫與保存

    1. 吸附柱置于新收集管,加入1-2 mL預熱洗脫液TB,室溫放置5分鐘;

    2. 8000 rpm離心2分鐘,收集質(zhì)粒溶液,-20℃保存。

3. 實驗后處理

  • 廢棄物處理

    • 含內(nèi)毒素的菌體沉淀及濾液按生物危害品處理;

    • 染菌的耗材121℃高壓滅菌30分鐘。

  • 儀器維護

    • 吸附柱CP6為一次性耗材,禁止重復使用;

    • 離心機轉子用70%乙醇擦拭,避免腐蝕。

四、常見問題解答

Q1:提取的質(zhì)粒濃度低如何解決?
A:

  1. 檢查菌液OD600值,推薦高拷貝質(zhì)粒1.8-2.0,低拷貝質(zhì)粒2.0-2.5;

  2. 確保菌體懸浮,避免裂解不充分;

  3. 延長洗脫時間至10分鐘,或重復洗脫一次。

Q2:內(nèi)毒素殘留超標怎么辦?
A:

  1. 確認溶液P4與CS1過濾器未過期;

  2. 裂解液離心時間延長至15分鐘,確保內(nèi)毒素充分沉淀;

  3. 使用LAL法驗證內(nèi)毒素水平,必要時增加乙醇洗滌次數(shù)。

Q3:如何提高大質(zhì)粒(>10 kb)的得率?
A:

  1. 菌液量增加至300 mL,裂解液P1/P2/P4按比例增加至12 mL;

  2. 洗脫液TB預熱至70℃,洗脫體積增加至3 mL;

  3. 吸附后靜置10分鐘再離心,增強結合效率。




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